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靶向降解BRAF突變體V600E的PROTAC分子設(shè)計(jì)

發(fā)布日期:2020-09-08   來源:分子設(shè)計(jì)   瀏覽次數(shù):0
核心提示:導(dǎo)讀:加拿大多倫多大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)通過開發(fā)靶向BRAF(V600E)的PROTAC分子,提出了一種新型抑制BRAF(V600E)驅(qū)動的癌癥治療的概
 導(dǎo)讀:加拿大多倫多大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)通過開發(fā)靶向BRAF(V600E)的PROTAC分子,提出了一種新型抑制BRAF(V600E)驅(qū)動的癌癥治療的概念。

RAF家族激酶是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,為EGFR或小GTP激酶 RAS的下游蛋白,常見的信號通路為RAS–RAF–MEK–ERK途徑。通常通過突變RAS或RAF使其功能激活,使得下游靶蛋白過度磷酸化,導(dǎo)致通路信號失調(diào),最終引起癌癥的發(fā)生和發(fā)展。其中BRAF(V600E)是目前研究的重要靶點(diǎn),臨床上使用dabrafenib,vemurafenib和encorafenib等靶向抑制劑治療相關(guān)疾病。雖然這些抑制劑顯示出了抗BRAF(V600E)驅(qū)動腫瘤的活性,但由于RAS和EGFR等成分仍然存在,后期依然會通過RAS-ERK途徑的信號促進(jìn)腫瘤生長。此外,由于RAF蛋白容易二聚化,會導(dǎo)致這些藥物治療效果降低。因此,急需一類能克服這些問題的新藥。近期,加拿大多倫多大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)通過開發(fā)靶向BRAF(V600E)的PROTAC分子,提出了一種新型抑制BRAF(V600E)驅(qū)動的癌癥治療的概念。

 

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研究人員首先利用FDA已批準(zhǔn)的或者上在臨床前研究的BARF V600E的靶向抑制劑dabrafebib和BI 882370化合物與三種不同的E3泛素連接酶粘合劑(pomalidomide,thalidomide和VH023)進(jìn)行排列組合以及中間連接片段長度和連接位點(diǎn)的篩選,最終確定了能夠靶向降解BARFV600E的P4B以及陰性Protac分子P4BMe。在對于BARF家族中的其他蛋白進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn),P4B能夠?qū)R恍越到釨ARF V600E蛋白,并且降低了源頭化合物BI 882370的脫靶效應(yīng)。

 

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研究人員隨后利用黑色素瘤細(xì)胞A375(純和BARF V600E突變)確認(rèn)了P4B確實(shí)可以靶向降解 BRAF V600E蛋白,以及對下游ERK和MEK的磷酸化有顯著的抑制作用。并且通過利用MLN4924:類泛素化抑制劑;MG-132:蛋白酶體抑制劑;Pomalidomide:E3泛素連接酶粘合劑和蛋白泛素化檢測,證明了P4B通過給BRAF V600E蛋白標(biāo)記泛素化并通過蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。

 

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研究人員橫向?qū)Ρ攘薖rotac陽性分子P4B,陰性分子P4BMe和源頭化合物BI 882370的作用效果,發(fā)現(xiàn)P4B在抑制細(xì)胞增殖和降低下游蛋白磷酸化方面更好。但在持續(xù)作用效果方面,P4B并不能長效抑制下游蛋白的磷酸化,相反BI 882370的有效作用時間更長。然而利用SPR技術(shù)分析這些化合物和蛋白的親和力并沒有顯著的差別。因此,化合物在效果作用時間差異方面可能存在別的機(jī)制。

 

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研究人員在其他BRAF不同類型的細(xì)胞檢測了P4B的作用效果,發(fā)現(xiàn)在BRAF V600D和G466V突變體細(xì)胞中是有效的,尤其是在vemurafenib抗性細(xì)胞株A375-VR(其中一條染色體串聯(lián)突變)是有效的,說明P4B有望克服之前抑制劑耐藥問題。之前實(shí)驗(yàn)的所有細(xì)胞系都是RAS WT型的細(xì)胞。臨床上的抑制劑都是可以激活RAS,并且將BRAF V600E由單體狀態(tài)轉(zhuǎn)化二聚體狀態(tài),最終對這些抑制劑產(chǎn)生抗性。研究人員在將BRAF V600E細(xì)胞中的RAS敲出之后,P4B的功能不受影響.但RAS突變激活之后,P4B抑制細(xì)胞的增殖效果和降低下游蛋白的磷酸化效果都大大降低。因此,RAS的突變激活能夠使得細(xì)胞激活對P4B抵抗作用。

 

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但P4B 在BRAF其他突變體以及野生型(WT)中是幾乎無效的。P4B抑制細(xì)胞的增殖效果和降低下游蛋白的磷酸化效果都大大降低。為了探究P4B在BRAF V600E和WT之間的區(qū)別,利用IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P4B拉下蛋白中BRAF V600E多于BRAF WT。但在FP實(shí)驗(yàn)中,卻發(fā)現(xiàn)P4B和E3泛素連接酶(CRBN)以及BRAF V600E/BRAFWT三元復(fù)合物的結(jié)合并沒有明顯差異。MEK可以結(jié)合BRAF以影響P4B的結(jié)合,當(dāng)體系中加入MEK以及突變體MEK(F311S),F(xiàn)P實(shí)驗(yàn)證明P4B降解BRAF V600E和BRAFWT之間的差異是由于MEK的結(jié)合。

 

這項(xiàng)工作證明了PROTAC分子P4B能夠治療某些抗傳統(tǒng)抑制劑治療的BRAF突變驅(qū)動的細(xì)胞系的應(yīng)用前景,并且對于目前臨床上尚無藥物的BRAF串聯(lián)突變細(xì)胞系也是有一定效果,將來可以補(bǔ)充這方面的空白。另外,這項(xiàng)工作系統(tǒng)的闡明了P4B受MEK和BRAF WT相互作用傾向于降解BRAF V600E的作用機(jī)制,以及RAS的激活將BRAF V600E由單體狀態(tài)轉(zhuǎn)向二聚體狀態(tài)從而阻斷P4B的作用效果。未來如果利用中間連接片段或者新型E3泛素連接酶的粘合劑能夠?qū)RAF V600E固定在單體狀態(tài),將大大拓展PROTAC分子P4B的作用范圍以及未來臨床應(yīng)用前景。

 

參考文獻(xiàn)

Posternak, G., Tang, X., Maisonneuve, P. etal. Functional characterization of a PROTAC directed against BRAFmutant V600E. Nat Chem Biol (2020). 

 
 
 
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