高通量測(cè)序技術(shù)（也稱為第二代測(cè)序技術(shù)）對(duì)于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）或基因組的某個(gè)位置上的小片段序列（長(zhǎng)度通常小于50bp）的插入或缺失（insertion-deletion，InDel）檢測(cè)較準(zhǔn)確，但是對(duì)于較大的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)卻非常困難。第三代測(cè)序技術(shù)以不需要PCR擴(kuò)增和長(zhǎng)讀長(zhǎng)為標(biāo)志，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序，因此也被稱為單分子測(cè)序技術(shù)。目前，已有長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的第三代測(cè)序平臺(tái)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，并廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域，且有望在不久的將來用于臨床，進(jìn)一步提高基因組結(jié)構(gòu)變異等相關(guān)疾病檢出率。
測(cè)序技術(shù)不斷升級(jí)
2008年，Helicos BioSciences公司推出了全球第一款單分子測(cè)序平臺(tái)HeliScope，但該產(chǎn)品的序列讀長(zhǎng)較短，系統(tǒng)整體測(cè)序錯(cuò)誤率較高。隨后，針對(duì)單分子的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)。目前，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)是指單分子測(cè)序長(zhǎng)度不低于KB級(jí)別的技術(shù)平臺(tái)。如今，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)主要有Pacific Biosciences公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（single molecule realtime sequencing，SMRT）平臺(tái)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔測(cè)序（Nanopore）平臺(tái)。
單分子實(shí)時(shí)測(cè)序平臺(tái)
Pacific Biosciences公司開發(fā)的第三代測(cè)序技術(shù)稱為SMRT，該技術(shù)建立在兩項(xiàng)重要發(fā)明的基礎(chǔ)之上，有效攻克了測(cè)序領(lǐng)域測(cè)序讀長(zhǎng)短的重大難題。其中，零模波導(dǎo)孔（zero-mode waveguides，ZMWs）技術(shù)可使激發(fā)光被限定在單分子納米孔底部的一定范圍之內(nèi)，有效過濾背景噪音；熒光基團(tuán)通過結(jié)合在核苷酸的磷酸基團(tuán)上，能夠幫助DNA聚合酶完成一個(gè)全天然的DNA鏈合成過程。
基于該原理的具體產(chǎn)品有PacBio Sequel測(cè)序儀、PacBio Sequel Ⅱ測(cè)序儀。PacBio Sequel測(cè)序儀是率先實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用的第三代測(cè)序技術(shù)產(chǎn)品，其突破了傳統(tǒng)短讀長(zhǎng)測(cè)序的諸多技術(shù)瓶頸。PacBio Sequel Ⅱ測(cè)序儀是PacBio Sequel的升級(jí)款，可提供CLR Library和CCSlibrary（HIFI）兩種測(cè)序模式，其測(cè)序芯片上的導(dǎo)孔（ZMW）由100萬個(gè)增至800萬個(gè)，理論通量較PacBio Sequel測(cè)序儀提升了8倍。同時(shí)，CCS reads（測(cè)序片段）的單堿基準(zhǔn)確度也有了較大提升，同一片段在測(cè)序4次后，準(zhǔn)確度可達(dá)約99%。
納米孔單分子測(cè)序平臺(tái)
Nanopore是基于電信號(hào)測(cè)序的技術(shù)，原理是通過電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)單鏈核酸分子穿過納米尺寸的蛋白孔道，不同的堿基在通過納米孔道時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同阻斷程度和阻斷時(shí)間的電流信號(hào)，因此可根據(jù)電流信號(hào)識(shí)別每條核酸分子上的堿基信息，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單鏈核酸分子的測(cè)序。由于該測(cè)序技術(shù)的原理與其他平臺(tái)有較大差異，亦被稱為第3.5代或第四代測(cè)序技術(shù)。
Nanopore測(cè)序儀的具體產(chǎn)品種類較多，均為基于Nanopore芯片而搭建的平臺(tái)，大到由多個(gè)芯片陣列組成的PromehION、GridION系列測(cè)序儀，小到可以連接手機(jī)Type C接口、電腦USB接口的MnION系列便攜式測(cè)序儀。其中，PromethION是一款高通量、高樣本數(shù)的臺(tái)式系統(tǒng)，其具有48個(gè)測(cè)序芯片，每個(gè)芯片有多達(dá)3000個(gè)納米孔通道，總計(jì)達(dá) 14.4萬個(gè)納米孔通道?；谶@種模塊化設(shè)計(jì)，測(cè)序芯片既可單獨(dú)運(yùn)行也可同時(shí)運(yùn)行，尤其適用于大樣本量、具有龐大數(shù)據(jù)量的項(xiàng)目。
上述兩類第三代測(cè)序平臺(tái)均具有長(zhǎng)讀長(zhǎng)、無GC偏好性以及可直接檢測(cè)甲基化修飾等優(yōu)點(diǎn)。相較而言，SMRT平臺(tái)無錯(cuò)誤偏好，可通過增加數(shù)據(jù)糾錯(cuò)以提高測(cè)序準(zhǔn)確度；Nanopore平臺(tái)讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，可達(dá)到Mb級(jí)別，其中MnION測(cè)序儀的尺寸如手機(jī)大小，較為便攜（詳見表）。
應(yīng)用方向有待探索
目前，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的第三代測(cè)序平臺(tái)已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜動(dòng)植物基因組、微生物基因組、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組、微生物群體研究及人類基因組變異檢測(cè)等領(lǐng)域的科研項(xiàng)目中，以解決上述領(lǐng)域中檢測(cè)技術(shù)的瓶頸問題。
在疾病檢測(cè)方面，第三代測(cè)序技術(shù)基于其單分子檢測(cè)與長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的特點(diǎn)，在基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)、短串聯(lián)重復(fù)序列（微衛(wèi)星DNA）分析、單體型分析、真假基因區(qū)分、甲基化檢測(cè)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。盡管目前許多基于第二代測(cè)序技術(shù)的基因診斷產(chǎn)品已基本成熟，但因高通量測(cè)序技術(shù)存在讀長(zhǎng)短、對(duì)基因組覆蓋不均勻等局限，對(duì)SNP和InDel s檢測(cè)尚可，但對(duì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)卻無能為力。而第三代測(cè)序技術(shù)憑借長(zhǎng)讀長(zhǎng)、不需要PCR擴(kuò)增、無GC偏好性等優(yōu)勢(shì)，在用于腫瘤、遺傳病等基因檢測(cè)時(shí)，能夠進(jìn)行長(zhǎng)片段序列（長(zhǎng)度通常大于50bp）測(cè)定，可以檢測(cè)缺失、重復(fù)、倒位、易位等結(jié)構(gòu)變異，進(jìn)一步提高了疾病的檢出率，有效彌補(bǔ)了第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)的不足。
相較于第二代測(cè)序平臺(tái)，第三代測(cè)序平臺(tái)大幅提升了序列讀長(zhǎng)，但由于其錯(cuò)誤率、成本及對(duì)樣本要求都較高，算法、軟件、數(shù)據(jù)庫等配套技術(shù)仍需進(jìn)一步研究，目前該平臺(tái)仍處于科研項(xiàng)目應(yīng)用階段。針對(duì)上述問題，各平臺(tái)正不斷優(yōu)化升級(jí)相關(guān)技術(shù)，如PacBio測(cè)序儀的HIFI技術(shù)模式可有效提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度，Nanopore平臺(tái)也通過對(duì)Promet hION進(jìn)行設(shè)備升級(jí)以進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。相信隨著第三代測(cè)序平臺(tái)的不斷發(fā)展，其未來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化應(yīng)用后，將有效彌補(bǔ)目前針對(duì)基因組結(jié)構(gòu)變異等相關(guān)疾病檢測(cè)手段的空白。（作者單位：國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心）
