新藥開發(fā)的過(guò)程是漫長(zhǎng)、復(fù)雜和不確定的，高通量篩選(High-throughput screening，HTS)是小分子藥物設(shè)計(jì)中用于發(fā)現(xiàn)起始化合物的策略之一。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)對(duì)靶標(biāo)研究較少時(shí)，HTS是首選。根據(jù)與疾病的相關(guān)性，綜合考慮與其他靶標(biāo)的聯(lián)系以及創(chuàng)新性，來(lái)進(jìn)行HTS的靶標(biāo)或細(xì)胞模型的選擇。篩選技術(shù)的選擇是由靶標(biāo)的可篩選性及其假定的化學(xué)易變性決定的。不同的篩選技術(shù)適用于不同的靶標(biāo)，對(duì)篩選技術(shù)的評(píng)述對(duì)之后的HTS具有重要的指導(dǎo)作用。
進(jìn)行HTS有一定的先決條件，首先是靶標(biāo)的前期確證，其次是靈敏且穩(wěn)定的篩選方法，最后是結(jié)構(gòu)豐富的化合物庫(kù)。在HTS后，還需要對(duì)苗頭化合物進(jìn)行進(jìn)一步的確證。常用的方法是重新購(gòu)買，確認(rèn)純度，測(cè)定親和力和濃度梯度實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行多方法的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，再去卷積分析排除假陽(yáng)性。還可以利用靶標(biāo)蛋白的同源家族蛋白突變體等備選進(jìn)行特異性篩選，多向印證化合物的選擇性。
一、生化篩選體系
生化篩選利用純化的靶標(biāo)蛋白，在體外測(cè)定配體的結(jié)合或酶活性的抑制。這些分析通常采用競(jìng)爭(zhēng)形式進(jìn)行，即研究中的化合物必須取代已知的配體或底物。通常使用384孔板進(jìn)行檢測(cè)，一般采用20-50 μL的檢測(cè)體積，并使用光學(xué)方法讀出，如吸光度，熒光，或發(fā)光。熒光法由于其更易操作、高靈敏度和靈活性，已經(jīng)在很大程度上取代了傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記配體分析方法。常用的熒光檢測(cè)方法有以下幾種：
1.總熒光分析（Fluorescence intensity, FLINT）
在固定時(shí)間內(nèi)對(duì)孔的熒光值進(jìn)行積分如100 ms。常用于含染料的底物，在酶催化反應(yīng)后生成具有熒光的物質(zhì)，如蛋白酶介導(dǎo)的肽熒光基團(tuán)的裂解。FLINT會(huì)受到許多因素的影響，如被檢測(cè)物質(zhì)的自發(fā)熒光和淬滅（與被檢測(cè)物質(zhì)相互作用而非底物）以及加樣誤差等。一般來(lái)說(shuō)，用于標(biāo)記的染料的激發(fā)波長(zhǎng)越長(zhǎng)，從篩選化合物的光譜干擾就越小。
2. 熒光比率法（Ratiometric fluorescence methods）
常見的HTS篩選體系包括熒光偏振（FP）和熒光各向異性（FA）檢測(cè)。此方法相較FLINT更不易受人為因素的影響，通過(guò)測(cè)定分子一定時(shí)間的旋轉(zhuǎn)變化，表征相互作用對(duì)測(cè)定分子的影響。在這些技術(shù)中，使用偏振光來(lái)激發(fā)熒光團(tuán)，并使用平行于和垂直于入射光偏振的偏振器來(lái)測(cè)量熒光發(fā)射。當(dāng)染料標(biāo)記的分子隨時(shí)間翻轉(zhuǎn)時(shí)，發(fā)射信號(hào)會(huì)去偏振。與大分子的結(jié)合降低了熒光團(tuán)的遷移率，從而增加了偏振值或各向異性，并允許定量結(jié)合。因?yàn)椴煌瑹晒馑氐臒晒鈮勖煌么颂匦钥梢宰畲蠡Y選體系的靈敏度。有機(jī)染料如fluorescein和rhodamine熒光壽命約3-4 ns，當(dāng)它們與約0.5-10 kD的分子結(jié)合時(shí)，檢測(cè)靈敏度最高。所以熒光比率法最適合用于分子量差異很大的分子間相互作用的測(cè)定。
3. 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）
來(lái)自熒光供體的能量通過(guò)偶極-偶極相互作用被受體吸收。能量傳遞的效率取決于供體和受體之間的光譜重疊，它們的距離和相對(duì)方向，以及福斯特方程中的其他參數(shù)。常見的能量供受體距離是26 nm，適合許多蛋白-蛋白相互作用。
4. 時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）
是由熒光共振能量轉(zhuǎn)移衍生而來(lái)的一種篩選方法。具有長(zhǎng)壽命熒光(通常為100秒到毫秒)的鑭系化合物用作熒光供體，熒光蛋白或有機(jī)熒光團(tuán)(例如，別藻藍(lán)蛋白或Cy5)用作受體。然后對(duì)受體的熒光發(fā)射進(jìn)行門控(例如，延遲到50ms)，以便在信號(hào)采集時(shí)，被測(cè)化合物中短壽命有機(jī)熒光團(tuán)的熒光發(fā)射已經(jīng)衰減。典型的商業(yè)化合物庫(kù)里分子熒光壽命在皮秒范圍內(nèi)。此外，350 nm供體激發(fā)和670 nm受體發(fā)射之間的大斯托克斯位移進(jìn)一步有助于最小化背景信號(hào)。鑭系化合物的熒光發(fā)射也表現(xiàn)為多個(gè)窄波長(zhǎng)，這與有機(jī)染料的寬波長(zhǎng)發(fā)射不同，后者允許與熒光受體進(jìn)行多路復(fù)用。
5. 熒光壽命分析（Fluorescence lifetime analysis, FLA）
一種不太常見但有效的檢測(cè)方法，在高通量篩選中，F(xiàn)LA使用時(shí)域數(shù)據(jù)采集來(lái)確定樣品中存在的熒光物質(zhì)的壽命。FLA的理想染料是釕絡(luò)合物，其熒光壽命約為20 ns。與熒光強(qiáng)度的測(cè)量相比，壽命測(cè)量對(duì)樣品中其他材料的顏色(如測(cè)試化合物)的敏感性要低得多。此外，在分析數(shù)據(jù)時(shí)，兩種生命周期通常都適用，這允許刪除壽命較短的組分，類似于TR-FRET實(shí)現(xiàn)的效果。
6. Alphascreen
熒光發(fā)射的波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)長(zhǎng)，與其相反，AlphaScreen是一種非放射性的基于距離的分析方法，使用單線態(tài)氧敏化在較短的波長(zhǎng)上產(chǎn)生發(fā)射，從而避免熒光偽影。待測(cè)分子偶聯(lián)在兩種不同的水凝膠包覆微珠上。供體微珠含有光敏劑(酞菁衍生物)，當(dāng)被680 nm的光刺激時(shí)產(chǎn)生單線態(tài)氧。如果受體微珠(包含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物)貼近供體微珠，導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光和短的波長(zhǎng)的光發(fā)射(520-620 nm)。
二、基于親和力的篩選體系
基于結(jié)合的分析直接觀察庫(kù)里化合物與目標(biāo)蛋白的結(jié)合，而不考慮它們對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。上文所述的生物化學(xué)方法則是測(cè)量酶/受體功能的改變或探針/蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制。一般來(lái)說(shuō)，基于結(jié)合的測(cè)定法使用的生物物理技術(shù)比基于競(jìng)爭(zhēng)的篩選法更耗費(fèi)材料和時(shí)間，因此最常用于小型化合物庫(kù)?；诮Y(jié)合的方法也被用于具有挑戰(zhàn)性的孤兒靶點(diǎn)和藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的后期階段，如苗頭化合物驗(yàn)證、優(yōu)化和先導(dǎo)化合物的優(yōu)化。
1. 基于片段的藥物設(shè)計(jì)(Fragment-based drug design, FBDD)
一種特別適合生物物理方法的應(yīng)用。FBDD涉及片段的篩選，這些片段是小分子(<280 Da)，與蛋白質(zhì)形成弱相互作用，典型的解離常數(shù)在毫摩爾到微摩爾范圍內(nèi)。FBDD利用小化合物庫(kù)覆蓋更大的化學(xué)空間(例如,使用103的片段可能達(dá)到105 -106年傳統(tǒng)的HTS化合物庫(kù)的效果)，同時(shí)為藥物化學(xué)提供了一個(gè)靈活的起點(diǎn)。片段發(fā)現(xiàn)對(duì)于靶向蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和傳統(tǒng)化合物庫(kù)作用有限的難成藥靶標(biāo)特別有幫助。FBDD中最常用的方法是NMR(核磁共振)、表面等離子體共振和X射線晶體學(xué)。
2. 核磁共振（NMR）
NMR可用于配體檢測(cè)和蛋白質(zhì)檢測(cè)兩種模式。配體檢測(cè)的核磁共振測(cè)量在目標(biāo)蛋白存在時(shí)，配體質(zhì)子或其他核磁共振活性核的強(qiáng)度或弛豫的變化，通過(guò)從蛋白質(zhì)到配體的磁化轉(zhuǎn)移，稱為奧氏核效應(yīng)。通常使用1H-NMR，使用配體檢測(cè)模式，對(duì)蛋白質(zhì)沒有大小限制，只需要低濃度的蛋白質(zhì)，也不需要同位素標(biāo)記。但另一方面，基于配體的NMR可能無(wú)法區(qū)分特異性和非特異性的結(jié)合作用。雖然蛋白質(zhì)檢測(cè)核磁共振更費(fèi)力，但它提供了化合物結(jié)合位點(diǎn)的具體信息，特別是當(dāng)核磁共振峰被分配到特定的蛋白質(zhì)殘基時(shí)。因此，在初次篩選后，蛋白質(zhì)檢測(cè)NMR通常作為二次檢測(cè)。蛋白質(zhì)檢測(cè)NMR最常用的方法是1H-15N和1H-13C異核單量子關(guān)系(HSQC)，它們分別對(duì)蛋白質(zhì)主鏈或含甲基側(cè)鏈的化學(xué)環(huán)境變化非常敏感。最近，反膠束封裝已被提出，以擴(kuò)大核磁共振在FBDD中的檢測(cè)限度，這可能允許測(cè)量離解常數(shù)超過(guò)200 mM。
3. 表面等離子體共振（SPR）
一種非常靈敏的方法來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)兩個(gè)物種之間的結(jié)合，且可進(jìn)行高通量篩選。SPR測(cè)量金/玻璃/溶劑界面的折射率變化，即光在表面等離子體上損失的角度(“SPR dip”)。在典型的SPR實(shí)驗(yàn)中，小分子或蛋白質(zhì)流過(guò)靶標(biāo)或其他結(jié)合物質(zhì)被固定的表面。重要的是，折射率的變化與結(jié)合材料的質(zhì)量成正比；因此，SPR可以測(cè)量結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。通常，靶蛋白被固定在傳感器上，使用賴氨酸的共價(jià)連接或通過(guò)親和捕獲方法，如多組氨酸標(biāo)簽、生物素或Fc受體。這種形式允許每天測(cè)量數(shù)百個(gè)分子，但這可能受到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的限制?；蛘?，微陣列固定化化合物文庫(kù)提供更高的通量，但需要對(duì)文庫(kù)進(jìn)行化學(xué)修飾以固定化。為了區(qū)分特異性和非特異性結(jié)合，可以對(duì)已知配體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)或?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行突變驗(yàn)證。雖然SPR非常敏感，但它相對(duì)昂貴，需要嚴(yán)格控制緩沖液、溫度和懸浮顆粒物。
4. 生物膜層干涉（Biolayer interferometry, BLI）
與SPR原理類似，測(cè)量固定蛋白層與內(nèi)部參考層之間的信號(hào)干涉。這種技術(shù)更容易使用，但比SPR不敏感，因此通常用于測(cè)量蛋白質(zhì)之間的相互作用，而不是蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用。
5. 二次諧波產(chǎn)生（Second-harmonic generation, SHG）
另一種基于板的測(cè)量親和力的方法，測(cè)量384孔板中固定在脂質(zhì)雙分子層上的染料標(biāo)記蛋白的內(nèi)部總反射率的變化。信號(hào)的二次諧波分量對(duì)二次諧波活性染料(PyMPO衍生物)相對(duì)于表面的取向非常敏感(具有亞埃分辨率)，當(dāng)配體與目標(biāo)結(jié)合并改變其構(gòu)象時(shí)，信號(hào)的二次諧波分量會(huì)發(fā)生變化。因此，SHG能夠在化合物庫(kù)中篩選變構(gòu)或誘導(dǎo)構(gòu)象改變的分子。
6. 質(zhì)譜分析（MS）
廣泛用于篩選蛋白質(zhì)和小分子間的相互作用。一種常見的形式是親和選擇-質(zhì)譜(AS-MS)，其中蛋白質(zhì)和化合物池孵育，蛋白質(zhì)配體配合物從未結(jié)合的化合物中迅速分離，結(jié)合的配體然后用LC-ESI-MS解離和鑒定。蛋白質(zhì)配體配合物與未結(jié)合配體的分離可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)，如超濾或分子排阻層析。另外，蛋白質(zhì)分子加合物也可以在特定的環(huán)境下用質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)量，如二硫鍵結(jié)合化合物或共價(jià)化合物的篩選。
7. 熱漂移實(shí)驗(yàn)（DSF）
差示掃描熒光法（DSF）和熱漂移實(shí)驗(yàn)（Thermal shift assay, TSA）都是指的這一方法，通過(guò)檢測(cè)溫度升高時(shí)染料的熒光增加，測(cè)定蛋白質(zhì)的去折疊，這種染料與蛋白質(zhì)的疏水部分有親和力，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)展開時(shí)，疏水部分暴露出來(lái)，熒光增強(qiáng)。與目標(biāo)物結(jié)合的化合物使其穩(wěn)定并提高熔解溫度。
8. DNA編碼化合物庫(kù)（DNA-Encoded Library technology, DEL）
DEL是通過(guò)一種均分與合并的方法建立的，化學(xué)支架混合在一起，然后分開進(jìn)入容器為下一輪化學(xué)反應(yīng)。在每個(gè)容器中加入不同的化學(xué)取代物，然后再次合并和均分，以進(jìn)行下一個(gè)反應(yīng)。裂解池化學(xué)的產(chǎn)物是一種復(fù)雜的混合物，它可以包含數(shù)百萬(wàn)甚至數(shù)十億種化合物。對(duì)于DEL，開始的支架被標(biāo)記為獨(dú)特的DNA序列;在每個(gè)反應(yīng)步驟中，添加另一個(gè)DNA序列，作為添加的化學(xué)取代基的條形碼。然后，DNA條形碼編碼的混合物被應(yīng)用到含有感興趣的蛋白質(zhì)的微珠上。沖洗掉未結(jié)合的化合物，洗脫結(jié)合的化合物，并進(jìn)行PCR和二代測(cè)序，以確定哪些DNA偶聯(lián)化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合。
9. X射線晶體衍射（X-ray crystallography）
研究小分子/蛋白質(zhì)復(fù)合物的高分辨率方法。雖然X射線晶體學(xué)需要最多的蛋白質(zhì)(毫克)和結(jié)晶是耗時(shí)的，但它可以極大地促進(jìn)配體的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向設(shè)計(jì)，以改善親和力。目前高通量結(jié)晶方法已經(jīng)開發(fā)出來(lái)，并且衍射也有相應(yīng)的高通量設(shè)施，不過(guò)主要依賴于化合物浸泡（Soaking）的方法實(shí)現(xiàn)。
三、基于細(xì)胞的篩選體系
化學(xué)探針和藥物先導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)不僅可以基于與特定靶標(biāo)的相互作用，也可以基于它們誘導(dǎo)細(xì)胞/生物體表型的能力?；诩?xì)胞/生物體的篩選通常使用在1）理想的分子靶標(biāo)是未知的；2）生化方法不能充分重現(xiàn)靶標(biāo)反應(yīng)體系；3）理想的表型只存在于細(xì)胞背景下，如細(xì)胞分化等。功能性結(jié)果還可以提供大量的機(jī)制信息，如區(qū)分完全激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反向激動(dòng)劑和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。異質(zhì)性也可以被測(cè)量，特別是當(dāng)細(xì)胞可以可視化高內(nèi)涵成像時(shí)。最后，基于細(xì)胞的方法還可以報(bào)告化合物的膜通透性和細(xì)胞毒性，這是基于結(jié)構(gòu)的藥物開發(fā)失敗的主要原因。
基于細(xì)胞的方法可以應(yīng)用在藥物發(fā)現(xiàn)的整個(gè)進(jìn)程中：靶標(biāo)識(shí)別和驗(yàn)證、初篩、先導(dǎo)鑒定、先導(dǎo)優(yōu)化以及安全性和毒性篩選。常用的方法如下，細(xì)胞增殖、第二信使、報(bào)告基因、蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)、酵母雙雜法和基于顯微鏡的分析。細(xì)胞模型的選擇是至關(guān)重要的。人源建模中，細(xì)胞系通常被改造帶有報(bào)告基因或者其他特征。目前趨勢(shì)更多的是建立“疾病樣”模型，包括原代/患者來(lái)源的細(xì)胞和涉及3D細(xì)胞培養(yǎng)或多細(xì)胞種類的復(fù)雜培養(yǎng)。人們對(duì)使用灌注培養(yǎng)和其他微流體裝置來(lái)評(píng)估化合物對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)期影響也越來(lái)越感興趣。此外，小動(dòng)物模型，如線蟲和斑馬魚越來(lái)越多地被用作小分子篩選的高通量模型。
1. 細(xì)胞增殖（Cell viability）
細(xì)胞增殖常用于鑒定能殺死癌細(xì)胞或病原體的化合物，并可檢測(cè)在肝臟等器官中的潛在安全問(wèn)題。常用有效的活性測(cè)定方法是利用熒光素酶/熒光素在ATP依賴的反應(yīng)中發(fā)光來(lái)測(cè)定ATP含量。熒光素酶的檢測(cè)非常敏感(每孔可以檢測(cè)到少于10個(gè)細(xì)胞)，可以適用于1536孔板。染料如釕、阿爾瑪藍(lán)、雙偶氮化合物（MTT、MTS、XTT和WST-1）也可用于增殖測(cè)定，這些通常轉(zhuǎn)化產(chǎn)生熒光或者顏色來(lái)表明存活或者死亡。細(xì)胞活力也可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基中釋放的胞內(nèi)酶（蛋白酶，LDH）或用非膜熒光染料插入DNA（如碘化丙啶）來(lái)評(píng)估。
2. 報(bào)告基因（Reporter gene）
報(bào)告基因分析(也稱為信號(hào)通路分析)，報(bào)告蛋白的編碼序列是在相關(guān)通路的轉(zhuǎn)錄控制下引入的。報(bào)告基因的表達(dá)通過(guò)檢測(cè)發(fā)光或熒光，反映啟動(dòng)子激活或抑制的程度。觀察到的信號(hào)是整個(gè)通路的產(chǎn)物，被篩選的化合物可以在任何一點(diǎn)相互作用。常用的報(bào)告基因是CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、GAL(β-半乳糖苷酶）、LAC(β-內(nèi)酰胺酶)、LUC(熒光素酶)和GFP。報(bào)告基因方法的一個(gè)缺點(diǎn)是，它們通常需要長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)才能轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此增加了間接影響的可能性。最新的發(fā)展方法是使用不同的報(bào)告基因來(lái)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)通路。
3. 第二信使（Secondary messenger）
第二信使法檢測(cè)信使分子在通路中的表達(dá)或運(yùn)輸，比報(bào)告基因法提供更相近的響應(yīng)。這種檢測(cè)被廣泛用于GPCR靶標(biāo)。例如，如果靶標(biāo)激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+存儲(chǔ)，其活性可以直接使用鈣敏感染料(如氟-3，氟-4，基于水母發(fā)光蛋白的發(fā)光)測(cè)定。如果GPCR不能自然地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，它可以被設(shè)計(jì)成使用混雜或嵌合G蛋白(也被稱為通用適配器)刺激Ca2+信號(hào)。這些方法的一個(gè)特點(diǎn)是其快速的響應(yīng)時(shí)間，這需要在以秒的數(shù)量級(jí)內(nèi)整板注入化合物并CCD檢測(cè)，如FLIPR或FDSS。較慢的讀出分析，如arrestin或TANGO，也被開發(fā)用于GPCR篩選。熒光測(cè)定法已被開發(fā)用于測(cè)量其他信使，如K+，或其熒光信號(hào)隨膜電位變化的膜結(jié)合染料。
4. 蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析和雙雜交篩選（Protein-fragment complementation）
蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析(PCA，也被稱為雙分子熒光互補(bǔ))和雙雜交篩選可以檢測(cè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形成/抑制。PCA將單個(gè)檢測(cè)蛋白(熒光素酶，GFP, GAL)分成兩部分，融合到感興趣的蛋白質(zhì)互作分子上；如果伴侶結(jié)合，檢測(cè)蛋白重新形成，信號(hào)可被檢測(cè)到。在小分子篩選中，不可使用GFP，因?yàn)檫@兩個(gè)片段不可逆地結(jié)合，不能通過(guò)小分子的結(jié)合而解離。最近一種可逆性熒光互補(bǔ)結(jié)構(gòu)被報(bào)道，其通過(guò)一種結(jié)合小分子染料的蛋白，增強(qiáng)熒光。雙雜交(2H)篩選是另一種基于活性轉(zhuǎn)錄因子形成的互補(bǔ)方法。在雙雜中，DNA結(jié)合域與誘餌蛋白結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域與靶蛋白結(jié)合。報(bào)告基因(如GAL或LAC)插入啟動(dòng)子后，如果靶蛋白與誘餌結(jié)合，激活域與報(bào)告基因相連，激活報(bào)告基因并能被檢測(cè)到。在存在抑制蛋白質(zhì)互作的化合物時(shí)，激活被阻止。
5. 高內(nèi)涵顯微成像（High-content imaging）
HCS儀器自動(dòng)收集在多孔板中生長(zhǎng)的細(xì)胞的光學(xué)或熒光圖像;然后，這些圖像會(huì)自動(dòng)分析所選擇的任何可測(cè)量特征。典型的儀器可以讀四色熒光2- 40倍的目標(biāo)。寬視野和共焦工具都是可用的，頂級(jí)設(shè)備可以讀取到63倍的水浸目標(biāo)。在獲得圖像后，使用定量的圖像分析工具提取特征，并將其轉(zhuǎn)換為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)?？蓽y(cè)量的特征非常多。例如，從單一的DNA結(jié)合染料，可以測(cè)量核的大小、形狀、強(qiáng)度和紋理(像素到像素的可變性)。
四、靶標(biāo)識(shí)別
在通過(guò)基于表型的方法鑒定出有希望的先導(dǎo)化合物系列之后，需要鑒定出相應(yīng)的靶標(biāo)。這些技術(shù)通常用于開發(fā)中的臨床前分子，但同樣可以應(yīng)用于已批準(zhǔn)的目標(biāo)未知的藥物。識(shí)別一種化合物的靶標(biāo)將大大有助于理解其生理相關(guān)性，優(yōu)化其親和力，確定脫靶效應(yīng)，以及獲得新藥物的監(jiān)管批準(zhǔn)。靶標(biāo)去卷積方法可分為三大類:化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)和生物信息學(xué)比較法。一般來(lái)說(shuō)，這些方法的結(jié)果是通過(guò)敏感的體外試驗(yàn)驗(yàn)證的，如SPR。
1. 化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)（Chemical proteomics）
基于親和的方法是最古老和最直接的方法來(lái)闡明小分子靶標(biāo)。在一種流行的形式中，配體被固定在載體上(如磁珠)，與細(xì)胞裂解液孵育，使其與蛋白質(zhì)組相互作用。結(jié)合蛋白被洗脫，用胰蛋白酶消化成多肽，用液相色譜分離，然后用質(zhì)譜和生物信息分析(鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué))鑒定。定量質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)允許比較由生物活性配體拉下的蛋白量與那些結(jié)合到非活性的配體類似物(陰性對(duì)照)，從而區(qū)分非特異性結(jié)合。其他以親和力為基礎(chǔ)的形式也有報(bào)道，其中一些涉及到蛋白陣列的標(biāo)記，而不是配體，使用凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，或?qū)ε潴w進(jìn)行化學(xué)修飾，使其能以共價(jià)方式附著在細(xì)胞中的目標(biāo)物上。
基于親和分離的一個(gè)缺點(diǎn)是固定化和衍生化可以影響觀察到的結(jié)合親和。標(biāo)記也需要化學(xué)合成的專業(yè)知識(shí)，也可能不兼容所有的配體。在基于活性的蛋白質(zhì)分析(ABPP)中，配體與探針競(jìng)爭(zhēng)與特定靶標(biāo)類的成員結(jié)合。細(xì)胞熱漂移試驗(yàn)(CETSA)由熱漂移試驗(yàn)衍生來(lái)的，其中化合物被添加到細(xì)胞中。細(xì)胞或裂解物被加熱到不同的溫度，并監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的變性。配體的結(jié)合穩(wěn)定靶標(biāo)蛋白，使它們?cè)谳^高的溫度下才熔解。CETSA可通過(guò)凝膠電泳或質(zhì)譜檢測(cè)。
2. 生物信息學(xué)分析（In silico comparative profiling）
可以將所研究的分子對(duì)細(xì)胞表達(dá)譜或表型的影響與已知生物活性小分子參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的分子進(jìn)行比較，從而推斷出實(shí)驗(yàn)分子的靶標(biāo)和作用機(jī)制?？捎糜诒容^的表型譜包括遺傳、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和高內(nèi)涵顯微鏡數(shù)據(jù)。
3. 化學(xué)遺傳學(xué)（Chemical genetics）
化學(xué)遺傳方法確定基因表達(dá)水平如何改變化學(xué)制劑的效果。特別是，可以在全基因組范圍內(nèi)增加或減少基因產(chǎn)物的表達(dá)，并監(jiān)測(cè)配體誘導(dǎo)的表型變化。與其他靶標(biāo)去卷積策略相比，這提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如不局限于可溶性蛋白，并允許區(qū)分直接和間接結(jié)合物，這為藥物的作用機(jī)制提供了更深入的了解。最初，化學(xué)遺傳學(xué)研究在有限數(shù)量的唯一可行的生物模型像酵母利用包含基因片段的多拷貝質(zhì)粒，或通過(guò)比較減少基因的拷貝數(shù)的影響。如今，化學(xué)遺傳技術(shù)包括RNA干擾(RNAi)、條形碼開放閱讀框(ORF)庫(kù)和CRISPR篩選，這些技術(shù)能夠以系統(tǒng)和有效的方式干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的所有基因?；贑RISPR和RNAi的方法都適用于匯集篩選，因?yàn)檫@兩種系統(tǒng)(sgRNA或shRNA)的表達(dá)結(jié)構(gòu)都有DNA副本整合到基因組中，它們本身作為分子條形碼，為目標(biāo)基因編碼。
五、未來(lái)與展望
進(jìn)行藥物開發(fā)目前有兩條熱門的途徑，其一是根據(jù)基礎(chǔ)研究選擇具有重大意義的疾病靶標(biāo)，特異性設(shè)計(jì)HTS的篩選方法，選擇合適的靶向藥物庫(kù)進(jìn)行篩選，利用多重方法進(jìn)行苗頭化合物和先導(dǎo)化合物的鑒定與驗(yàn)證。其二是根據(jù)疾病特征性選擇合適的表型模型，根據(jù)表型的特征性，選擇合適的表型篩選體系進(jìn)行表型篩選實(shí)驗(yàn)，獲得先導(dǎo)化合物后進(jìn)行靶標(biāo)去卷積鑒定和驗(yàn)證作用靶標(biāo)，可再結(jié)合基于結(jié)構(gòu)的藥物篩選進(jìn)行進(jìn)一輪的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提升藥效，綜合各藥物設(shè)計(jì)策略的長(zhǎng)處，開發(fā)原創(chuàng)新型藥物。
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110102000668（1）號(hào)